Kemasaman Tanah

1.    Kenapa curah hujan tinggi dikatakan sebagai penyebab kemasaman tanah utama? Jelaskan!

Curah hujan ini merupakan besarnya kapasitas hujan yang turun ke permukaan yang berwujud air. Curah hujan akan berpengaruh terhadap keku`tan erosi dan pencucian tanah, sedangkan pencucian tanah yang cepat menyebabkan tanah menjadi asam (pH tanah menjadi rendah). Pada umumnya makin banyak curah hujan maka keasaman tanah makin tinggi atau pH tanah makin rendah, karena banyak unsur-unsur logam alkali tanah yang terlindi misalnya, Na, Ca, Mg, dan K. Curah hujan yang tinggi ditambah lagi dengan temperatur yang tinggi menyebabkan terjadinya pelapukan yang intensif, proses mineralisasi berjalan sangat intensif. Air yang berlebih menyebabkan pencucian hasil-hasil mineralisasi terutama kation-kation basa (Ca, Mg, K, Na) yang mengakibatkan pada kompleks jerapan tanah dipenuhi oleh ion H⁺ dan A^l+++.  Dan sebaliknya makin rendah curah hujan maka makin rendah tingkat keasaman tanah dan makin tinggi pH tanah. Makin lembab suatu tanah maka makin jelek aerasinya dan juga sebaliknya, hal ini desebabkan karena adanya pergantian antara air dan udara dalam tanah. 

Selain itu makin tinggi curah hujan dan makin intensif penggunaan lahan pertanian, maka makin besar kemungkinan berkembangnya tanah-tanah masam. Curah hujan yang melebihi evapotraanspirasi mempunyai kemampuan bagi terjadinya perkolasi air ke dalam lapisan tanah yang lebih dalam, sehingga terjadi pencucian kation-kation basa (alkali dan lakali tanah seperti kalium, natrium, kalsium, dan magnesium). Tercucinya kation-kation basa dari kompleks jerapan menyebabkan kation-kation H+ dan Al3+ menjadi dominan, sehingga tanah menjadi masam.

2.    Kemasaman potensial jauh lebih berbahaya daripada kemasaman aktif. Bagaimana ini bisa terjadi?

Kemasaman tanah ditentukan oleh dinamika ion H+ di dalam tanah, ion H+ yang terdapat dalam suspensi tanah berada keseimbangan dengan ion H+ yang terjerap. Akibat dari proses itu, maka dikenal 2 jenis kemasaman yaitu kemasaman aktif dan kemasaman potensial. Kemasaman aktif disebabkan oleh ion H+ di dalam larutan tanah, sedangkan kemasaman potensial disebabkan oleh ion H+ dan Al3+ yang terjerap pada permukaan kompleks jerapan.               ( Hardjowigeno, 2003).

Kemasaman tanah potensial jauh lebih besar bahayanya dibandingkan dengan kemasaman tanah aktif karena jika ditinjau dari efek dan penyebabnya sendiri kemasaman tanah potensial jauh lebih complex disbanding dengan kemasaman tanah aktif. . Kemasaman aktif hanya diakibatkan oleh Ion‑ion H+ bebas yang kemudian diukur dan dinyatakan sebagai pH tanah. Tipe kemasaman ini mempengaruhi pertumbuhan tanaman.

Namun pada kondisi kemasaman tanah potensial diakibatkan oleh terjerapnya ion H+ dan Al3+ yang menyebabkan tanah menjadi sangat masam dan dapat meracuni tanaman. keamsaman tanah tidak hanya semata-mata disebabkan oleh ion H+ tetapi kemasaman tanah juga  disebabkan oleh oleh aktivitas ion Al3+. Reaksi hidrolisis Al3+ menghasilkan ion H+ adalah sebagai berikut:

Al3+ + H2O < ------ > Al(OH)2+ + H+

Al(OH)2+ + H2O < ------ > Al(OH)2+ + H+

Al(OH)2+ + H20 < ------ > Al(OH)3 + H+ (Tisdale & Nelson, 1975).

Hakim dkk (1986), menyatakan dalam keadaan yang sangat masam, Al menjadi sangat larut yang dijumpai dalam bentuk kation Al3+ dan hidroksida Al. Kedua ion Al itu lebih mudah terjerap pada koloid liat daripada ion H. Oleh karena Al berada dalam larutan tanah mudah terhidrolisis, maka Al merupakan penyebab kemasaman atau penyumbang ion H. Ion H yang dibebaskan secara demikian akan memberikan nilai pH rendah bagi larutan tanah dan mungkin merupakan sumber utama ion H dalam sebagian besar tanah masam.

Aluminium yang dapat dipertukarkan (Al-dd) dan Kejenuhan Aluminium Al dalam bentuk dapat ditukarkan (Al-dd) umumnya terdapat pada tanahtanah yang bersifat masam dengan pH < 5,0. Aluminium ini sangat aktif karena berbentuk Al3+ monomer yang sangat merugikan dengan meracuni tanaman atau mengikat fosfor. Oleh karena itu untuk mengukur sejauh mana pengaruh Al ini perlu ditetapkan kejenuhannya. Semakin tinggi kejenuhan aluminium, akan semakin besar bahaya meracun terhadap tanaman. Kandungan aluminium dapat tukar (Al3+) mempengaruhi jumlah bahan kapur yang diperlukan untuk meningkatkan kemasaman tanah dan produktivitas

tanah (Anonimous, 2009).

Kadar aluminium sangat berhubungan dengan pH tanah. Semakin rendah pH tanah, maka semakin tinggi aluminium yang dapat dipertukarkan dan sebaliknya. Disamping kadar aluminium yang dapat dipertukarkan, pengaruh jelek aluminium diukur dengan derajat penjenuhan aluminium yang dinyatakan dengan: Hakim, dkk (1986) menyatakan bahwa keracunan aluminium menghambat perpanjangan dan pertumbuhan akar primer, serta menghalangi pembentukan akar lateral dan bulu akar. Apabila pertumbuhan akar terganggu, serapan hara dan pembentukan senyawa organik tersebut akan terganggu. Sistem perakaran yang terganggu akan mengakibatkan tidak efisiennya akar menyerap unsur hara. kelarutan ion Al dan H yang sangat tinggi, sehingga merupakan factor penghambat tumbuh tanaman yang utama pada tanah masam (Rafi’i, 1990).

Siklus Hara Tertutup

1.Kenapa tanaman di hutan dapat tumbuh subur dan hasilnya bagus, padahal tidak ada yang memeliharanya?

JAWAB:

Hal ini dikarenakan siklus hara berlangsung secara seimbang dan dalam keteraturan secara alami. Diantaranya hara-hara yang diserap oleh tanaman menyebabkan tumbuhan hutan tumbuh subur. Seiring berjalannya waktu seperti proses pertumbuhan dan perkembangan tanaman akan mengalami proses yang dinamakan adaptasi-tumbuh hungga senses. Pepohonan beserta tanaman yang mengelilinginya lambat laun daun, ranting, batang atau organ tanaman lain akan gugur jatuh kedalam tanah. Yang lama kelamaan akan membusuk dan akhirnya menyatu menjadi unsur hara didalam tanah. Sehingga dengan adanya bagian-bagian tanaman yang jatuh ke tanah otomatis akan membantu mengembalikan jumlah unsur hara kedalam tanah. Jadi disini dapat dilihat ada proses penyerapan unsur hara sekaligus pengembalian unsur hara yang diambil ke dalam tanah oleh tanaman. selain  itu di dalam hutan juga terdapat beragam flora maupun fauna yang sangat beranekaragam. Dengan adanya proses-proses alami hewan juga nantinya akan mengalami kematian dan menjadi bangkai. Bangkai tersebut akan mengalami proses pembusukan sehingga bisa menjadi salah satu bahan yang dapat diurai oleh decomposer menjadi unsur hara didalam tanah. Nah, dengan adanya proses siklus yang beraturan dan alami dalam ekosistem hutan mengakibatkan tanaman-tanaman maupun hewan yang sudah mengalami proses dekomposisi oleh decomposer dan berlanjut dengan proses demineralisasi membantu mengembalikan kandungan unsur hara kedalam tanah. Proses siklus tertutup ini berlangsung dengan keteraturan dan seimbang tanpa adanya campur tangan dari manusia.sehingga tanpa adanya pemupukan tumbuhan yang hidup di hutan dapat tumbuh dengan subur.

2.Bisakah kita membudidayakan tanaman dengan menggunakan sistem yang terjadi pada tanaman hutan?

JAWAB:

BISA, Karena dengan menerapkan siklus hara tertutup nantinya justru akan mendukung proses alam yang balance (seimbang). Dengan mengadopsi system yang terjadi di hutan justru kita seperti menerapkan system pertanian organic, ada proses take and give di ekosistem sawah. Dimana unsur hara yang diserap oleh tanaman dari dalam tanah nantinya juga akan dikembalikan melalui sersah/sampah/sisa tanaman maupun organisme yang ada di ekosistem tersebut. Sehingga kita dapat membantu mempertahankan tingkat kesuburan tanah dari degradasi atau  kerusakan lahan akibat penggunaan bahan-bahan kimia yang berlebihan. Semisal saja pertanian budidaya padi. Pastinya banyak unsur hara yang diserap oleh tanaman tersebut sehingga mengurangi jumlah unsur hara dalam sawah. Namun dengan membiarkan sisa/bekas jerami di sawah untuk beberapa waktu hingga membusuk akan efektif dalam membantu pegembalian unsur hara ke lingkungan sehingga nantinya ketika areal tersebut akan diusahakan suatu komoditas yang sama atau yang lainnya tetap akan mendukung produksi yang maksimal.

Pupuk An-organik (kesuburan tanah)

1.    Apa saja Keuntungan dan kerugian penggunaan pupuk tunggal dan pupuk majemuk?

PUPUK TUNGGAL

Keuntungan	Kerugian
1.    Kadar hara tinggi 2.    Dosis fleksibel 3.    Mudah aplikasi 4.    Mudah tersedia/ 5.    Release 6.    Bebas impuritis	1.    Hanya mengandung satu jenis hara 2.    Biaya transpor dan 3.    Simpan tinggi 4.    peluang terjadi kelangkaan

PUPUK MAJEMUK

Keuntungan	Kerugian
1.    Hara > satu unsur 2.    Formula pupuk fixed/bervariasi 3.    Hemat biaya dan waktu aplikasi 4.    Hemat biaya simpan	1.    Kandungan hara belum Tentu sesuai dengan kebutuhan 2.    Masih perlu tambahan pupuk tunggal 3.    Harga per unit hara lebih tinggi dibanding pupuk tunggal 4.    Tidak semua jenis pupuk dapat dicampur

2. Kenapa kandungan hara dalam tanah berbeda-beda?

 Karena tanah memiliki jenis-jenis yang berbeda, pada jenis yang beda maka kandungan haranya juga berbeda. Tanah merupaka lapisan permukaan bumi teratas yang tersusun atas pasir, hasil pelapukan bebatuan serta sisa-sisa hasil makhluk hidup seperti tumbuhan dan hewan lainnya. Pembentukan tanah dipengaruhi oleh batuan induk penyusun tanah tersebut, curah hujan, intensitas penyinaran matahari, dan lapisan penutup tanah tersebut. Akibat adanya interaksi factor-faktor pembentuk tanah tersebut, tanah yang terbentuk dapat beranekaragam.karena terbentuknya lapisan tanah latar belakangnya tidak sama, menyebabkan unsure hara yang terkandung didalamnya juga berbeda-beda.

 Selain itu dipengaruhi oleh cara pengelolaannya. Masing-masing jenis tanah mempunyai prosentase komponen penting tanah yang berbeda-beda. Komponen penting tersebut yaitu bahan mineral tanah, bahan organik ,air tanah dan udara tanah. Kombinasi keempat faktor tersebut akan menghasilkan jenis tanah dengan kandungan hara yang beda-beda. Dalam pembentukan tanah sehingga menghasilkan kandungan hara tergantung juga akan faktor pembentuk tanah pada khususnya yaitu bahan induknya, iklim ,makhluk hidup , topografi,waktu.

Menurut blair (1979) terdapat tiga factor penting yang mempengaruhi perbedaan ketersediaan unsur-unsur hara didalam tanah yaitu, suplai dari fase padat, pH tanah, dan suplai air.

1)        Suplai dari fase padat

Kemampuan tanah untuk mengatur suplai tersedianya unsur hara dari fase padat bervariasi tergantung jenis unsur haranya, tiga factor penting yang berkaitan dengan fase padat adalah : jerapan atau pertukaran anion dan kation, lambatnya ketersediaan unsur hara di dalam larutan garam dan bahan organik.

Laju pelepasan ion mineral melalui, tiga factor penting yang berkaitan dengan fase padat adalah : jerapan atau pertukaran anion dan kation, lambatnya ketersediaan unsur hara di dalam larutan garam dan bahan organik.

Laju pelepasan ion mineral melalui kompleks jerapan tergantung pada ikatan dalam permukaan tersebut. Kation dipegang oleh kekuatan elektrostatik sehingga dapat digerakan kembali ke fase cainon yang di jerap oleh permukaan akar. Unsur hara yang dilepas ke larutan tanah melalui mineralisasi bahan organik. Bahan organik berasal dari residu tanaman,apabila bahan organik ditambahkan ke dalam tanah maka mengalami penguraian dan akan dilepas unsur-unsur haranya ketanah. Unsur –unsur tersebut dapat berupa unsur mikro dan makro yang nantinya bisa berguna untuk tanaman dan tanah jadi tahan tercuci.

2)        pH tanah

Tersedianya unsur hara sangat eraqt hubungannya dengan pH. Diukur dengan sekala log perubahan pH sebesar satu unit berarti terjadi sepuluh kali perubahan konsentrasi ion H⁺ atau OH^-.

Contoh spesifik pengaruh pH tanah terhadap ketersediaan unsur hara adalh pada pH kisaran 4-9, secara  normal di larutan tanah terdapat dua jenis ion P, HPO₄ dan H₂PO₄.

Aktivitas biologi didalam tanah juga dipengaruhi oleh pH tanah. Pengaruhnya didalam kecepatan penguraian bahan organik. Pada ph sekitar 6-7, mikrooerganisme tanah paling aktif mengurai bahan organik dan membantu cepatnya ketersediaan unsur hara di dalam tanah.sehingga daya produktivitas tanah pun semakin bertambah.

3)        suplai air

Status air tanah berpengaruh terhadap kertersediaan unsur hara bagi tanaman . pada kandungan air tanah yang rendah dapat mengakibatkan rendahnya konsentrasi unsur hara yang ada di dalam larutan tanah.

Dan juga tanaman dalam pertumbuhannya membutuhjkan air sebagai bahan dasar fotosintesis.

Bioteknologi

1.    a. Bioteknologi merupakan cabang ilmu biologi yang mempelajari pemanfaatan organisme, sistem, atau proses biologi untuk menghasilkan produk berupa barang atau jasa yang berguna untuk meningkatkan kesejahteraan manusia. Perkembangan bioteknologi didukung oleh perkembangan cabang ilmu yang lain yaitu mikrobiologi, genetika, fisika, kimia biokimia, fisiologi, dan lain-lain. Bioteknologi memberikan harapan besar untuk meningkatkan kesejahteraan manusia dengan berbagai terobosan yang dilakukannya.

b. Perbedaan bioteknologi konvensional dan modern

Perbedaannya terletak pada prinsip-prinsip ilmiah yang digunakan. Bioteknologi konvensional masih menggunakan prinsip-prinsip ilmiah yang sederhana. Sedangkan bioteknologi modern telah menggunakan prinsip-prinsip genetika dan biologi molekuler. Jadi dalam bioteknologi konvensional belum melibatkan rekayasa genetika dan bioteknologi modern telah melibatkan rekayasa genetika.

Berikut perbedaan bioteknologi konvensional dan modern. Yang di tampilkan dalam tabel berikut.

sifat	konvensional	modern
Penggunaan teknik.	Peragian/fermentasi.	DNA rekombinan.
Campur tangan manusia.	Terbatas dan secara alami.	Mengubah sifat makhluk hidup
Produk hasil	Alcohol,kecap, tauco, keju, tempe, tape, dan yoghurt.	Tomat tahan lama, kapas tahan lama, dan jagung berprotein tinggi.

2.    Jika kloning gen ke dalam suatu bakteri menggunakan plasmid pBR322. Baik plasmid maupun DNA sumber gen donor  dipotong dg enzim PstI .  Jelaskan bagaimana cara membedakan bakteri yg membawa  plasmid rekombinan dan bakteri yang membawa plasmid asli/ utuh.

Jawab:

Bakteri yang membawa plasmid rekombinan dicirikan dengan Bakteri yg membawa plasmid yg telah terpotong pada gen amp^r  tidak lagi tahan dalam media yg mengandung ampisilin namun resisten terhadap tetrasiklin. Sehingga bakteri dengan plasmid rekombinan dapat tumbuh di media yang mengandung tetrasiklin tetapi tidak dapat tumbuh di media yang mengandung ampisilin.  Sedangkan bakteri yang membawa plasmid utuh/asli dicirikan dengan plasmid yg telah terpotong pada gen amp^r   tahan dalam media yg mengandung ampisilin maupun tetrasiklin.

3.      Dari  transkripsi DNA berikut,  anda diminta      menggambarkan  urutan mRNA  hasil transkripsi yang berbentuk struktur batang dan lengkungan (loop) sebagai pertanda transkripsi segera diakhiri

JAWAB:

4.    Jelaskan kenapa enzim endonuclease  restriksi  tipe 2 banyak digunakan untuk  memotong gen dalam bioteknologi modern.   Berikan contohnya.

Jawab:

Enzim endonuklease restriksi adalah enzim yang dapat mengenali dan memotong kedua utas DNA (Deoxy Ribonucleic Acid) pada urutan basa tertentu. Enzim ini akan mencari sekuens spesifiknya dengan cara menempel pada DNA secara spesifik maupun nonspesifik, kemudian berdifusi secara linier dengan kecepatan tertentu hingga ditemukan sekuens spesifik yang dikenalinya untuk dipotong. Berikut adalah contoh daftar mikroba penghasil enzim retriksi beserta sekuen pengenalnya.

NAMA ENZIM	SEKUENS PENGENAL	ORGANISME ASAL
EcoRI	G AATTC	Escherichia coli
HindIII	A AGCTT	Haemophilus influenzae
HhaI	GCG C	Haemophilus haemolyticus
TaqI	T CGA	Thermus aquaticus
BsuRI	GG CC	Bacillus subtilis
BalI	TGG CCA	Brevibacterium albidum
NotI	GC GGCCGC	Nocardia otidis-caviarum
BamHI	G GATCC	Bacillus amylolyquefaciens
SmaI	CCC GGG	Serratia marcescens

Oleh karena itu, enzim ini memiliki peranan penting dalam berbagai teknik molekuler dan genetika, misalnya untuk analisis gen dan kloning gen yang bermanfaat. Bidang ilmu dan teknologi pangan juga memanfaatkan enzim ini, misalnya dalam mendeteksi patogen pangan secara molekuler. Enzim ini juga bermanfaat untuk pengembangan produk-produk pertanian, seperti varietas kedelai tahan hama, kentang tahan virus, analisis gen, konstruksi pangan transgenik, dan beragam produk hasil pengembangan lainnya.

Dalam bidang biologi molekuler, enzim endonuklease restriksi dimemanfaatkan untuk melakukan modifikasi terhadap materi genetik (Asam Deoksiribonukleat atau DNA) organisme tertentu. Modifikasi tersebut bertujuan memperoleh varietas tertentu dengan karakteristik yang lebih baik dari organisme sebelumnya. Contoh lainnya, enzim tersebut digunakan juga untuk pemetaan DNA, kloning gen, analisis proses degenerasi sel, karakterisasi gangguan genetik menurun pada DNA, analisis keterkaitan filogenetik, dan sebagainya. Secara alami pada bakteri fungsi enzim endonuklease restriksi berperan untuk menghancurkan DNA asing yang masuk, seperti infeksi bakteriofage dengan cara memotong DNA asing tersebut pada sekuens yang dikenalinya. Dengan demikian, keberadaan enzim ini pada organisme merupakan suatu mekanisme pertahanan tubuh organisme dari DNA asing.

Isolasi DNA & Elektroforesi

TUGAS BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

ISOLASI DNA & ELEKTROFORESIS

Disusun Oleh:

NAMA	:	TANTRIATI
NIM	:	12011025

PROGRAM KEAHLIAN AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS AGROINDUSTRI

UNIVERSITAS MERCU BUANA YOGYAKARTA

2014

ISOLASI DNA & ELEKTROFORESIS

A.  Isolasi DNA

Penelitian pada bidang molekuler saat ini telah banyak dilakukakan untuk berbagai keperluan. Teknik biologi molekuler telah memberikan peluang untuk mengembangkan dan mengidentifikasi peta genetik dari suatu kultivar tanaman. Pendekatan genetika molekuler dengan menggunakan penanda DNA telah berhasil membentuk penanda molekuler yang mampu dalam mendeteksi gen dan sifat-sifat tertentu, evalusi keragaman dan evolusi pada tingkat genetik.

DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.

Dewasa ini telah banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan ilmu pengetahuan terutama dalam ilmu Genetika. Isolasi DNA telah banyak dilakukan dan dikembangkan di dunia ilmiah karena teknologi – teknologi modern telah menjamah ilmu genetika. Isolasi DNA ini dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, hingga dengan teknologi modern. Mengenai hal ini, pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Namun, penggunaan tumbuhan sebagai sumber lebih banyak dilakukan dalam pengisolasian DNA dewasa ini. Pengisolasian DNA pada sumber dilakukan terutama untuk pengenalan DNA secara lebih jelas karena dari isolasi ini DNA dapat terpisah dari kumpulannya, yaitu kromosom. Setelah dilakukan isolasi, biasanya DNA akan dielektroforesis.

Langkah awal yang sangat menentukan dalam keberhasilan penelitian molekuler yang berbasis pada DNA adalah kualitas DNA yang diperoleh dari tahapan isolasi. Kemurnian dan kualitas DNA yang diperoleh dari tahap ini akan sangat menentukan dalam penelitian penelitian biologi molekuler. Tiga langkah utama dalam isolasi DNA adalah perusakan dinding sel atau lisis, pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Surzycki, 2000).

Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel. Setelah dilakukan inkubasi, sitoplasma sel yang telah bercampur dengan pelisis sel tersebut lalu disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel. Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk mem-bersihkan nukleus sel dari zatzat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein, se-hingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling), yang menyebabkan DNA menjadi terlihat.

DNA yang diperoleh dari isolasi dengan bahan biji sangat kotor dan smear, hal ini berarti bahwa metabolit-metabolit yang terkandung di dalam biji tidak dapat dibersihkan secara sempurna pada proses isolasi, sehingga tidak diperoleh DNA yang murni. Sedangkan pada daun proses pemurniaan DNA dapat terjadi lebih sempurna sehingga dapat diperoleh DNA yang murni, hal ini ditandai dengan pita DNA yang jelas dan bersih. Menurut Peccia dan Hernandez (2006) bahwa pada dasarnya prinsip dari isolasi DNA terdiri dari melisiskan sel dan memurnikan asam nukleat (DNA). Lisis merupakan perusakan dinding dan melepaskan DNA, hal ini bisa dilakukan dengan cara fisik maupun kimia. Pemurniaan DNA merupakan proses untuk memisahkan DNA dari lisat sel (protein, karbihidrat, lipid) dan kontaminan lain.

Kandungan senyawa fenol, lipid, dan juga senyawa lainnya yang tinggi, pada bagian biji dibandingkan dengan bagian daun, menyebabkan sulitnya memperoleh DNA yang murni dari biji pada saat proses isolasi. Sebaliknya kandungan metabolit yang rendah pada bagian daun menyebabkan isolasi lebih mudah dilakukan, sehingga dapat diperoleh DNA dengan kualitas yang baik.

B.  Elektroforesis

Difinisi Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul (TITRAWANI 1996). Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi (RICARDSON dkk. 1986).

Menurut STENESH dalam TITRAWANI (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga.

Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapaun menurut SARGENT & GEORGE (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik.

Kegunaan Metode Elektroforesis

Telah disebutkan di atas bahwa pola protein tertentu dari satu spesies hewan berbeda, secara elektroforesis akan memperlihatkan pola protein yang berbeda pula pada hewan lainnya. Faktor tersebutlah yang menyebabkan pola protein dapat digunakan untuk membedakan spesies hewan. Perbedaan pola protein inilah yang seringkali digunakan sebab untuk membedakan populasi secara tepat kadangkala tidak dapat dilakukan apabila hanya menggunakan pengamatan melalui morfologis saja. Fenomena ini pula yang menyebabkan metode elektroforesis banyak dilakukan untuk pengamatan taksonomi, sistematik dan genetik serta untuk mengindentifikasi spesies hewan maupun tumbuhan (bio-sistematik). Dapat pula digunakan untuk melihat phylogenetic recon-struction (rekonstruksi secara Filogenetik) dari suatu jenis hewan atau tumbuhan.

Elektroforesis

Sebelum dilakukan percobaan sebaiknya disiapkan dahulu alat dan bahan kimia yang akan digunakan. Alat yang biasa digunakan adalah tabung Eppendorf, mikropipet, tip, mortat, tabung Erlenmeyer, gelas ukur, penangas air (dengan suhu 80°C), magnetic stir-rer, magnectic bar, sentrifuga, pinset, timbangan, pompa vacum, cetakan gel 20 x 16 x 1 cm3, timer, meja pendingin, pembungkus plastik, freezer, kawat halus untuk memotong gel, inkubator, power supply, pisau, penggaris, spidol, kantong plastik tebal untuk menyimpan gel setelah pewarnaan, nampan plastik, spons dan alat-alat tulis.

Sedangkan untuk bahan kimia yang digunakan, tergantung dari hewan atau tumbuhan enzim apa yang akan diuji. Seperti misalnya larutan pengekstra yang digunakan untuk jenis udang-udangan berdasarkan DICKSON dkk, (1983) adalah menggunakan sistem enzim Esterase (EST), dan Malat dehidrogenase (MDH). WIKNESWARI (1995) menggunakan Malik Enzim (ME), serta

CHELIAK & PITEL (1984) menggunakan Phosphat glukosa isomerase (PGI) dan lain sebagainya. Untuk menentukan sistem enzim tersebut sebelumnya dilakukan uji optimalisasi terlebih dahulu terhadap hewan yang akan diujikan.

Cara kerja terdiri dari beberapa tahap yaitu:

1. Ekstraksi enzim

Setelah sample dibersihkan ditempatkan di dalam mortar dan diberi larutan pengekstrak sebanyak + 200 μ (tergantung dari banyak, sedikitnya sampel atau besar kecilnya sampel). Kemudian sampel digerus hingga halus. Penggerusan dilakukan pada kondisi dingin (+4°C) dan dilakukan di dalam meja pendingin, agar suhu tetap konstan. Hasil gerusan tersebut dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan kemudian dilakukan sentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang didapat dipisahkan dari endapan, yang selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan disimpan dalam lemari pendingin (Freezer) dengan suhu sekitar -70°C.

2. Pembuatan gel pati.

Pembuatan gel pati biasanya bermacam-macam. Ada yang berasal dari pati kentang, dan lain sebagainya. Setelah ditentukan banyaknya pati, maka diberikan larutan buffer morfolin sitrat dengan pH 6.1 sebanyak 350 ml di dalam labu erlenmeyer 1000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan dalam penangas air dengan suhu + 80 °C, selama 25 menit. Panaskan lagi dengan magnetic bar dan diaduk dengan menggunakan magnetic strirer selama 5 menit hingga mengental membentuk gel yang bening.

Setelah gel mendidih, dilakukan pengisapan gelembung udara dengan cara diisap dengan "water jet pump" dan setelah dingin, gel dituangkan ke dalam cetakan gel yang berukuran 20 x 16 x 1 cm3 hingga rata dan biarkan mengeras pada suhu kamar lebih kurang 60menit.

3. Penempatan sampel

Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan menggunakan pisau. Bagian ujung gel diiris kira 2 cm dari salah satu tepinya yaitu dari arah kotada yang dipakai sebagai penyimpan ekstra enzim.

Ekstrak enzim yang akan diuji dikeluarkan dari freezer dan biarkan sebentar hingga mencair. Pengambilan ekstrak enzim dilakukan dengan cara mencelupkan kertas saring berukuran 6x15 mm ke ekstrak enzim. Potongan kertas saring yang telah berisi ekstrak enzim diletakkan dengan posisi tegak lurus ke celah irisan gel. Jarak antara celah 1-1.5 mm. Sebagai indikator adanya pergerakkan maka pada celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.

4. Proses elektroforesis

Gel yang telah siap kemudian diletakkan secara horizontal di atas kotak elektroforesis yang telah berisi larutan penyangga elektroda. Proses ini dilakukan di dalam lemari pendingin dengan suhu 4 °C.

Kedua sisi gel diberi spons yang telah dibasahi dengan larutan penyangga elektroda sebagai jembatan antar larutan penyangga elektroda dengan gel. Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin. Proses elektroforesis dijalankan dengan memberi daya listrik pada gel. Pemberian daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya sebesar 50 - 70 μA, 50-60 μA atau 45-55 μA selama kurang lebih 3 jam.

Setelah terlihat bahwa biru brom fenol mencapai titik yang berjarak + 3 cm dari ujung gel, maka proses elektroforesis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai dipotong, sedangkan potongan gel yang menjadi tempat migrasi enzim diiris tipis secara horizontal dengan menggunakan gergaji yang berkawat tipis. Gel diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar diletakkan dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuai enzim yang akan dianalisis.

5. Visualisasi sistem enzim

Visualisasi sistem dilakukan dengan pewarna biokimia. Dengan komposisi yang telah ditentukan sebelumnya.

6. Metode analisis

Dalam hal ini cara menganalisa hasil pita dari elektroforesis tersebut sangat tergantung dari topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzin berupa bintik atau noda yang disebut pola pita (bandmorp). Macam pola pita dibedakan atas tipe pola pita yang terbentuk. Semua tipe pola pita yang berbentuk diinterpretasikan sebagai lokus isozim dan alel yang kemudian dijadikan dasar dalam pengukuran parameter-parameter yang ada dalam suatu populasi (NEI 1977; BROWN & WEIR 1983; ROTHE 1995). Lokus isozim adalah struktur gen yang memiliki kemampuan menghasilkan enzim pengkatalisis reaksi biokimia tertentu, sedangkan alel adalah salah satu dari dua atau lebih bentuk gen yang dapat muncul pada satu lokus (SUZUKI dkk. 1993).

Metode analisis dapat dilakukan dengan beberapa cara misalnya metode analisis ekspresi alel, atau metode analisis fenetik dan lain sebagainya.

Sedangkan untuk menangani sampel dari mulai pengambilan di lapangan hingga penyimpangan dapat diterangkan sebagai berikut:

l.Koleksi Sampel

Agar proses elektroforesis dapat berhasil dengan baik, tidak lepas dari proses pengambilan sampel di lapangan. Untuk pengambilan sampel sangat diperlukan

pengertian dan pengetahuan yang benar terhadap metode serta sampling yang digunakan. Disamping juga pengetahuan mengenai dasar bio-kimia dari protein. Karena proses elektroforesis sangat berpengaruh dengan jaringan-jaringan dan protein yang terdapat pada hewan koleksi.

Sampel yang akan diambil sedapat mungkin harus segar atau untuk hewan diusahakan agar tetap hidup dan tidak boleh diawetkan dengan menggunakan bahan pengawet alkohol ataupun formalin. Atau apabila hewan tersebut mati, maka sebaiknya disimpan dalam bentuk dingin atau membeku (masukkan dalam ice box yang diberi dry es atau masukkan ke dalam larutan nitrogen cair).

2. Penanganan dan Penyimpanan Sampel

Apabila telah diperoleh sampel yang diinginkan, maka sampel segera dibawa ke laboratorium untuk disimpan ke dalam freezer dengan suhu -50°C. Sampel-sampel tersebut dapat disimpan dalam jangka waktu panjang, hingga proses elektroforesis siap dilakukan. Sebelum dimasukkan ke dalam freezer, sampel disimpan dalam kotak plastik atau bila dalam bentuk jaringan atau supernatan dapat dimasuukan ke dalam tabung Eppendorf.