Isolasi DNA & Elektroforesi

TUGAS BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

ISOLASI DNA & ELEKTROFORESIS

Disusun Oleh:

NAMA	:	TANTRIATI
NIM	:	12011025

PROGRAM KEAHLIAN AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS AGROINDUSTRI

UNIVERSITAS MERCU BUANA YOGYAKARTA

2014

ISOLASI DNA & ELEKTROFORESIS

A.  Isolasi DNA

Penelitian pada bidang molekuler saat ini telah banyak dilakukakan untuk berbagai keperluan. Teknik biologi molekuler telah memberikan peluang untuk mengembangkan dan mengidentifikasi peta genetik dari suatu kultivar tanaman. Pendekatan genetika molekuler dengan menggunakan penanda DNA telah berhasil membentuk penanda molekuler yang mampu dalam mendeteksi gen dan sifat-sifat tertentu, evalusi keragaman dan evolusi pada tingkat genetik.

DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.

Dewasa ini telah banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan ilmu pengetahuan terutama dalam ilmu Genetika. Isolasi DNA telah banyak dilakukan dan dikembangkan di dunia ilmiah karena teknologi – teknologi modern telah menjamah ilmu genetika. Isolasi DNA ini dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, hingga dengan teknologi modern. Mengenai hal ini, pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Namun, penggunaan tumbuhan sebagai sumber lebih banyak dilakukan dalam pengisolasian DNA dewasa ini. Pengisolasian DNA pada sumber dilakukan terutama untuk pengenalan DNA secara lebih jelas karena dari isolasi ini DNA dapat terpisah dari kumpulannya, yaitu kromosom. Setelah dilakukan isolasi, biasanya DNA akan dielektroforesis.

Langkah awal yang sangat menentukan dalam keberhasilan penelitian molekuler yang berbasis pada DNA adalah kualitas DNA yang diperoleh dari tahapan isolasi. Kemurnian dan kualitas DNA yang diperoleh dari tahap ini akan sangat menentukan dalam penelitian penelitian biologi molekuler. Tiga langkah utama dalam isolasi DNA adalah perusakan dinding sel atau lisis, pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Surzycki, 2000).

Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel. Setelah dilakukan inkubasi, sitoplasma sel yang telah bercampur dengan pelisis sel tersebut lalu disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel. Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk mem-bersihkan nukleus sel dari zatzat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein, se-hingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling), yang menyebabkan DNA menjadi terlihat.

DNA yang diperoleh dari isolasi dengan bahan biji sangat kotor dan smear, hal ini berarti bahwa metabolit-metabolit yang terkandung di dalam biji tidak dapat dibersihkan secara sempurna pada proses isolasi, sehingga tidak diperoleh DNA yang murni. Sedangkan pada daun proses pemurniaan DNA dapat terjadi lebih sempurna sehingga dapat diperoleh DNA yang murni, hal ini ditandai dengan pita DNA yang jelas dan bersih. Menurut Peccia dan Hernandez (2006) bahwa pada dasarnya prinsip dari isolasi DNA terdiri dari melisiskan sel dan memurnikan asam nukleat (DNA). Lisis merupakan perusakan dinding dan melepaskan DNA, hal ini bisa dilakukan dengan cara fisik maupun kimia. Pemurniaan DNA merupakan proses untuk memisahkan DNA dari lisat sel (protein, karbihidrat, lipid) dan kontaminan lain.

Kandungan senyawa fenol, lipid, dan juga senyawa lainnya yang tinggi, pada bagian biji dibandingkan dengan bagian daun, menyebabkan sulitnya memperoleh DNA yang murni dari biji pada saat proses isolasi. Sebaliknya kandungan metabolit yang rendah pada bagian daun menyebabkan isolasi lebih mudah dilakukan, sehingga dapat diperoleh DNA dengan kualitas yang baik.

B.  Elektroforesis

Difinisi Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul (TITRAWANI 1996). Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi (RICARDSON dkk. 1986).

Menurut STENESH dalam TITRAWANI (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga.

Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapaun menurut SARGENT & GEORGE (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik.

Kegunaan Metode Elektroforesis

Telah disebutkan di atas bahwa pola protein tertentu dari satu spesies hewan berbeda, secara elektroforesis akan memperlihatkan pola protein yang berbeda pula pada hewan lainnya. Faktor tersebutlah yang menyebabkan pola protein dapat digunakan untuk membedakan spesies hewan. Perbedaan pola protein inilah yang seringkali digunakan sebab untuk membedakan populasi secara tepat kadangkala tidak dapat dilakukan apabila hanya menggunakan pengamatan melalui morfologis saja. Fenomena ini pula yang menyebabkan metode elektroforesis banyak dilakukan untuk pengamatan taksonomi, sistematik dan genetik serta untuk mengindentifikasi spesies hewan maupun tumbuhan (bio-sistematik). Dapat pula digunakan untuk melihat phylogenetic recon-struction (rekonstruksi secara Filogenetik) dari suatu jenis hewan atau tumbuhan.

Elektroforesis

Sebelum dilakukan percobaan sebaiknya disiapkan dahulu alat dan bahan kimia yang akan digunakan. Alat yang biasa digunakan adalah tabung Eppendorf, mikropipet, tip, mortat, tabung Erlenmeyer, gelas ukur, penangas air (dengan suhu 80°C), magnetic stir-rer, magnectic bar, sentrifuga, pinset, timbangan, pompa vacum, cetakan gel 20 x 16 x 1 cm3, timer, meja pendingin, pembungkus plastik, freezer, kawat halus untuk memotong gel, inkubator, power supply, pisau, penggaris, spidol, kantong plastik tebal untuk menyimpan gel setelah pewarnaan, nampan plastik, spons dan alat-alat tulis.

Sedangkan untuk bahan kimia yang digunakan, tergantung dari hewan atau tumbuhan enzim apa yang akan diuji. Seperti misalnya larutan pengekstra yang digunakan untuk jenis udang-udangan berdasarkan DICKSON dkk, (1983) adalah menggunakan sistem enzim Esterase (EST), dan Malat dehidrogenase (MDH). WIKNESWARI (1995) menggunakan Malik Enzim (ME), serta

CHELIAK & PITEL (1984) menggunakan Phosphat glukosa isomerase (PGI) dan lain sebagainya. Untuk menentukan sistem enzim tersebut sebelumnya dilakukan uji optimalisasi terlebih dahulu terhadap hewan yang akan diujikan.

Cara kerja terdiri dari beberapa tahap yaitu:

1. Ekstraksi enzim

Setelah sample dibersihkan ditempatkan di dalam mortar dan diberi larutan pengekstrak sebanyak + 200 μ (tergantung dari banyak, sedikitnya sampel atau besar kecilnya sampel). Kemudian sampel digerus hingga halus. Penggerusan dilakukan pada kondisi dingin (+4°C) dan dilakukan di dalam meja pendingin, agar suhu tetap konstan. Hasil gerusan tersebut dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan kemudian dilakukan sentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang didapat dipisahkan dari endapan, yang selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan disimpan dalam lemari pendingin (Freezer) dengan suhu sekitar -70°C.

2. Pembuatan gel pati.

Pembuatan gel pati biasanya bermacam-macam. Ada yang berasal dari pati kentang, dan lain sebagainya. Setelah ditentukan banyaknya pati, maka diberikan larutan buffer morfolin sitrat dengan pH 6.1 sebanyak 350 ml di dalam labu erlenmeyer 1000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan dalam penangas air dengan suhu + 80 °C, selama 25 menit. Panaskan lagi dengan magnetic bar dan diaduk dengan menggunakan magnetic strirer selama 5 menit hingga mengental membentuk gel yang bening.

Setelah gel mendidih, dilakukan pengisapan gelembung udara dengan cara diisap dengan "water jet pump" dan setelah dingin, gel dituangkan ke dalam cetakan gel yang berukuran 20 x 16 x 1 cm3 hingga rata dan biarkan mengeras pada suhu kamar lebih kurang 60menit.

3. Penempatan sampel

Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan menggunakan pisau. Bagian ujung gel diiris kira 2 cm dari salah satu tepinya yaitu dari arah kotada yang dipakai sebagai penyimpan ekstra enzim.

Ekstrak enzim yang akan diuji dikeluarkan dari freezer dan biarkan sebentar hingga mencair. Pengambilan ekstrak enzim dilakukan dengan cara mencelupkan kertas saring berukuran 6x15 mm ke ekstrak enzim. Potongan kertas saring yang telah berisi ekstrak enzim diletakkan dengan posisi tegak lurus ke celah irisan gel. Jarak antara celah 1-1.5 mm. Sebagai indikator adanya pergerakkan maka pada celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.

4. Proses elektroforesis

Gel yang telah siap kemudian diletakkan secara horizontal di atas kotak elektroforesis yang telah berisi larutan penyangga elektroda. Proses ini dilakukan di dalam lemari pendingin dengan suhu 4 °C.

Kedua sisi gel diberi spons yang telah dibasahi dengan larutan penyangga elektroda sebagai jembatan antar larutan penyangga elektroda dengan gel. Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin. Proses elektroforesis dijalankan dengan memberi daya listrik pada gel. Pemberian daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya sebesar 50 - 70 μA, 50-60 μA atau 45-55 μA selama kurang lebih 3 jam.

Setelah terlihat bahwa biru brom fenol mencapai titik yang berjarak + 3 cm dari ujung gel, maka proses elektroforesis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai dipotong, sedangkan potongan gel yang menjadi tempat migrasi enzim diiris tipis secara horizontal dengan menggunakan gergaji yang berkawat tipis. Gel diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar diletakkan dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuai enzim yang akan dianalisis.

5. Visualisasi sistem enzim

Visualisasi sistem dilakukan dengan pewarna biokimia. Dengan komposisi yang telah ditentukan sebelumnya.

6. Metode analisis

Dalam hal ini cara menganalisa hasil pita dari elektroforesis tersebut sangat tergantung dari topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzin berupa bintik atau noda yang disebut pola pita (bandmorp). Macam pola pita dibedakan atas tipe pola pita yang terbentuk. Semua tipe pola pita yang berbentuk diinterpretasikan sebagai lokus isozim dan alel yang kemudian dijadikan dasar dalam pengukuran parameter-parameter yang ada dalam suatu populasi (NEI 1977; BROWN & WEIR 1983; ROTHE 1995). Lokus isozim adalah struktur gen yang memiliki kemampuan menghasilkan enzim pengkatalisis reaksi biokimia tertentu, sedangkan alel adalah salah satu dari dua atau lebih bentuk gen yang dapat muncul pada satu lokus (SUZUKI dkk. 1993).

Metode analisis dapat dilakukan dengan beberapa cara misalnya metode analisis ekspresi alel, atau metode analisis fenetik dan lain sebagainya.

Sedangkan untuk menangani sampel dari mulai pengambilan di lapangan hingga penyimpangan dapat diterangkan sebagai berikut:

l.Koleksi Sampel

Agar proses elektroforesis dapat berhasil dengan baik, tidak lepas dari proses pengambilan sampel di lapangan. Untuk pengambilan sampel sangat diperlukan

pengertian dan pengetahuan yang benar terhadap metode serta sampling yang digunakan. Disamping juga pengetahuan mengenai dasar bio-kimia dari protein. Karena proses elektroforesis sangat berpengaruh dengan jaringan-jaringan dan protein yang terdapat pada hewan koleksi.

Sampel yang akan diambil sedapat mungkin harus segar atau untuk hewan diusahakan agar tetap hidup dan tidak boleh diawetkan dengan menggunakan bahan pengawet alkohol ataupun formalin. Atau apabila hewan tersebut mati, maka sebaiknya disimpan dalam bentuk dingin atau membeku (masukkan dalam ice box yang diberi dry es atau masukkan ke dalam larutan nitrogen cair).

2. Penanganan dan Penyimpanan Sampel

Apabila telah diperoleh sampel yang diinginkan, maka sampel segera dibawa ke laboratorium untuk disimpan ke dalam freezer dengan suhu -50°C. Sampel-sampel tersebut dapat disimpan dalam jangka waktu panjang, hingga proses elektroforesis siap dilakukan. Sebelum dimasukkan ke dalam freezer, sampel disimpan dalam kotak plastik atau bila dalam bentuk jaringan atau supernatan dapat dimasuukan ke dalam tabung Eppendorf.